大客車不能在高速公路上行駛的時間是凌晨兩點至五點。 根據(jù)《道路旅客運輸企業(yè)安全管理規(guī)范》四十五條規(guī)定，夜間上路行駛的客運車輛必須在凌晨2點至5點之間停在附近的安全區(qū)域。同時，司機應(yīng)及時提醒車上乘客不要隨意走動。 根據(jù)《道路旅客運輸企業(yè)安全管理規(guī)范》第三十八條 客運企業(yè)在制定運輸計劃時應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格遵守客運駕駛員駕駛時間和休息時間等規(guī)定：1.日間連續(xù)駕駛時間不得超過4小時，夜間連續(xù)駕駛時間不得超過2小時，每次停車休息時間應(yīng)不少于20分鐘；2.在24小時內(nèi)累計駕駛時間不得超過8小時；3.任意連續(xù)7日內(nèi)累計駕駛時間不得超過44小時，期間有效落地休息；4.禁止在夜間駕駛客運車輛通行達(dá)不到安全通行條件的三級及以下山區(qū)公路； 5.長途客運車輛凌晨2時至5時停止運行或?qū)嵭薪玉g運輸；從事線路固定的機場、高鐵快線以及短途駁載且單程運營里程（查成交價|參配|優(yōu)惠政策）在100公里以內(nèi)的客運車輛，在確保安全的前提下，不受凌晨2時至5時通行限制；